Sélectivité fonctionnelle des ligands : utilisation de Gnu R

Publié le 17 juillet 2012

Introduction

Dans un billet pré­cé­dant, je pré­sen­tais une pro­cé­dure pour évaluer le biais d’un ligand, c’est-à-dire sa sélec­ti­vité fonc­tion­nelle. Cet arti­cle montre com­ment le logi­ciel Gnu R peut auto­ma­ti­ser les prin­ci­pa­les étapes du calcul menant à déter­mi­ner si un ligand est biaisé ou non.

Évaluation de la sélectivité fonctionnelle d’un ligand

L’une des étapes impor­tan­tes du calcul pour l’évaluation de la sélec­ti­vité fonc­tion­nelle consiste à uti­li­ser les prin­ci­pes du modèle opé­ra­tion­nel pour déter­mi­ner τ, une mesure de l’effi­ca­cité d’un ligand à acti­ver une voie de signa­li­sa­tion [1] [2]. Pour rappel, dans ce modèle, la réponse (E) est dépen­dante de la réponse maxi­male pos­si­ble (Em), de la concen­tra­tion d’ago­niste ([A]), de la cons­tante de dis­so­cia­tion (Kd) et de la cons­tante de trans­duc­tion (τ). L’équation est la sui­vante :


frac{E}{E_m} = frac{tau [A]}{tau [A] + ([A] + K_D)}

Graphiquement, la courbe décrite par le modèle opé­ra­tion­nel res­sem­ble à une courbe concen­tra­tion réponse typi­que. Plus le maxi­mum de la courbe se rap­pro­che de 1, plus τ est grand.

Dans le défi­ni­tion de ce modèle, la cons­tante τ repré­sente l’inverse de la frac­tion de récep­teurs occu­pés lors de l’obten­tion de 50 % de la réponse maxi­male Em. Donc, si τ = 1, tous les récep­teurs sont occu­pés à 50 % de la réponse maxi­male. Si τ = 10, ce n’est que 10 % des récep­teurs qui sont occu­pés. Si τ = 2, 50 % des récep­teurs sont occu­pés à 50 % de la réponse maxi­male (donc 50 % de la réponse maxi­male au Kd). Dans le cas où τ est infé­rieur à 1, le 50 % de la réponse maxi­male ne peut pas être atteint. Pour une même voie de signa­li­sa­tion, τ est direc­te­ment pro­por­tion­nel à l’effi­ca­cité du ligand à géné­rer une signa­li­sa­tion, mais dépend aussi de l’ampli­fi­ca­tion de la signa­li­sa­tion en aval de la liai­son du ligand. Lors d’une même expé­rience, l’ampli­fi­ca­tion du signal est la même et le rap­port du τ d’un ligand sur celui du ligand de réfé­rence donne une mesure de l’effi­ca­cité du ligand pour une voie de signa­li­sa­tion (σ).


sigma_{lig} = logleft(frac{tau_{lig}}{tau_{ref}}right)

Alors que τ dépend for­te­ment de l’état du sys­tème de signa­li­sa­tion, comme par exem­ple du nombre de récep­teurs de réserve ou sim­ple­ment de l’état des cel­lu­les, σ n’en dépend pas (pour une bonne expli­ca­tion, voir la figure 1 de Rajagopal et al (2011) [1]). C’est ce der­nier para­mè­tre qu’il est pré­fé­ra­ble d’uti­li­ser pour cal­cu­ler le biais d’un ligand vers une voie de signa­li­sa­tion, tou­jours par rap­port à l’ago­niste de réfé­rence.

De l’expérience à σ

La façon expé­ri­men­tale de déter­mi­ner l’effi­ca­cité d’un ligand pour une voie de signa­li­sa­tion est d’effec­tuer une courbe concen­tra­tion réponse typi­que. Suite à l’enre­gis­tre­ment des répon­ses indui­tes par les ligands à dif­fé­ren­tes concen­tra­tions, plu­sieurs étapes sont néces­sai­res afin de cal­cu­ler σ. Voici un bref aperçu des étapes de l’ana­lyse des don­nées :

  1. Mesure de la réponse d’une série de ligands, à différentes concentrations.
  2. Pour plus de précision, les expériences sont faites, au minimum, en duplicata. Pour avoir une idée de la variabilité des données, il est bien de calculer la moyenne et l’écart-type pour toutes les concentrations.
  3. Pour comparer les courbes entre elles, il est préférable de soustraire l’activité basale moyenne des lectures brutes, pour chacun des ligands.
  4. Évaluation de l’EC50 et de la réponse maximale par régression non-linéaire, pour chacun des ligands.
  5. Il est préférable d’exprimer la réponse des différents ligands en fonction de la réponse maximale du système (E/Em).
  6. Illustration graphique de la courbe concentration réponse, superposée aux points expérimentaux moyens et leurs l’écart-types, afin de vérifier visuellement que tout est conforme.
  7. Évaluation de τ par régression non-linéaire, pour chacun des ligands.
  8. Illustration graphique du modèle opérationnel, encore une fois pour vérifier visuellement que tout est conforme.
  9. Réunion des courbes concentration réponse de chacun des ligands sur un même graphique afin de les comparer entre elles.
  10. Évaluation de σ pour chacun des ligands.
  11. Réunion des données dans un tableau résumé.

En fait, les étapes sont nom­breu­ses et très répé­ti­ti­ves. Il est alors judi­cieux d’auto­ma­ti­ser ces dif­fé­ren­tes étapes pour garder son énergie et son temps à tirer des conclu­sions réflé­chies.

Utilisation de Gnu R pour automatiser l’analyse

Gnu R est un logi­ciel libre per­met­tant d’ana­ly­ser des don­nées et tracer des gra­phi­ques faci­le­ment. Il est gra­tuit et sur­tout très fiable. Il est pos­si­ble de le télé­char­ger pour un grand nombre de sys­tème d’exploi­ta­tion sur http://www.r-pro­ject.org/.

Organisation des don­nées brutes

La pre­mière étape consiste à orga­ni­ser les don­nées brutes dans un fichier texte dont les colon­nes sont sépa­rées par des tabu­la­tions. La pre­mière colonne est la concen­tra­tion des ligands en molaire, alors que toutes les autres colon­nes sont les répon­ses brutes. La pre­mière ligne est l’iden­ti­fiant de chacun des ago­nis­tes et la deuxième ligne le Kd. Le moyen le plus simple pour obte­nir ce fichier est de copier/coller à partir de Microsoft Excel ou tout autre logi­ciel simi­laire. L’ordre des concen­tra­tions n’est pas impor­tant dans ce fichier. Voici un exem­ple :

Analyse par Gnu R

Une fois le fichier des don­nées brutes enre­gis­tré, il suffit de lancer le script R par un double clic avec la souris. Le script va ainsi géné­rer plu­sieurs fichiers per­met­tant d’inter­pré­ter ou pré­sen­ter les résul­tats :

  1. Un fichier Excel des moyennes avant soustraction du niveau basal.
  2. Un fichier Excel des Écart-types avant soustraction du niveau basal.
  3. Un fichier Excel des moyennes E/Em avec soustraction du niveau basal.
  4. Un fichier Excel des Écart-types E/Em avec soustraction du niveau basal.
  5. Un fichier PDF contenant un graphique de la courbe concentration réponse et un graphique du modèle opérationnel pour chacun des agonistes (avec points + Écart-Type). Ce PDF contient également un graphique comparant toutes les courbes concentrations réponse, exprimées en E/Em ou % du maximum ainsi que toutes les courbes du modèle opérationnel.
  6. Un fichier Excel contenant les valeurs de l’EC50 et de τ en plus de quelques données statistiques permettant de les évaluer.
  7. Un fichier texte contenant encore plus de données statistiques pour chacun des agonistes.

Voici un exem­ple de la courbe concen­tra­tion réponse ainsi que de la courbe du modèle opé­ra­tion­nel pour le ligand Ago2.

Voici un autre exem­ple des gra­phi­ques qui com­pa­rent les ligands entre eux. À gauche, on retrouve les cour­bes concen­tra­tion réponse de tous les ligands. Au centre, ce sont les mêmes cour­bes expri­mées en % du maxi­mum pour bien visua­li­ser les dif­fé­ren­ces dans l’EC50 des ligands. Enfin, à droite, on retrouve les cour­bes du modèle opé­ra­tion­nel avec des repè­res per­met­tant d’évaluer l’ordre de gran­deur de τ.

Comment fonctionne Gnu R ?

Gnu R n’est pas un logi­ciel avec une inter­face gra­phi­que comme Excel ou Graphpad Prism. Il se rap­pro­che plus d’un lan­gage de pro­gram­ma­tion, d’où sa grande puis­sance. Pour le faire fonc­tion­ner, il faut écrire des lignes de code rela­ti­ve­ment simple et très bien docu­men­tés. Cet arti­cle n’a pas comme ambi­tion de vous ensei­gner la pro­gram­ma­tion avec Gnu R. Par contre, si vous voulez savoir à quoi ça res­sem­ble et com­ment ça fonc­tionne, il est pos­si­ble de télé­char­ger le code source de mon script et un fichier de don­nées fic­ti­ves à ana­ly­ser. Notez que le script était encore à l’étape de pro­to­type lors de la rédac­tion de cet arti­cle et que vous devriez véri­fier que tout est conforme avant de l’uti­li­ser pour vos tra­vaux.

Conclusion

L’uti­li­sa­tion de Gnu R faci­lite gran­de­ment l’ana­lyse des don­nées pour l’étude de la sélec­ti­vité fonc­tion­nelle. Il est une bonne alter­na­tive aux logi­ciels comme Graphpad Prism qui est beau­coup plus res­tric­tif lors­que vient le temps d’auto­ma­ti­ser les tâches.

Notes

[1Sudarshan Rajagopal, Seungkirl Ahn, David H. Rominger, William Gowen-MacDonald, Christopher M. Lam, Scott M. DeWire, Jonathan D. Violin, et Robert J. Lefkowitz. 2011. Quantifying Ligand Bias at Seven-Transmembrane Receptors. Mol Pharmacol 80:367-377

[2Black JW et Leff P. 1983. Operational models of pharmacological agonism. Proc R Soc Lond B Biol Sci 220:141–162.

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