Analyse d’image efficace avec R

Publié le 17 janvier 2016

Introduction

L’idée d’ana­ly­ser des images de micro­sco­pie à fluo­res­cence avec un logi­ciel de sta­tis­ti­que peut sem­bler excen­tri­que au pre­mier abord. Cependant, elle s’avère en réa­lité plutôt avan­ta­geuse puis­que le logi­ciel R pos­sède de nom­breux outils per­for­mants pour mani­pu­ler des don­nées sous forme de matrice, géné­rer des sta­tis­ti­ques ainsi que pour tracer des gra­phi­ques. Il existe d’ailleurs des exten­sions qui per­met­tent de trai­ter des images direc­te­ment dans R. Dans cet arti­cle, un exem­ple d’uti­li­sa­tion spé­cia­lisé de R pour l’ana­lyse d’images de micro­sco­pie à fluo­res­cence sera décrit.

EBImage : l’extension d’analyse d’image puissante

EBImage est une exten­sion qui permet d’ana­ly­ser et trai­ter pra­ti­que­ment n’importe quel type d’images dans R. Elle fait partie inté­grante de Bioconductor (http://bio­conduc­tor.org/), une dis­tri­bu­tion d’outils spé­cia­li­sés dans l’ana­lyse à haut débit avec R. EBImage est donc par­ti­cu­liè­re­ment adapté pour le trai­te­ment d’images pro­ve­nant de la micro­sco­pie à fluo­res­cence lors de tests in vitro. L’exten­sion pos­sède des outils sim­ples pour détec­ter auto­ma­ti­que­ment les cel­lu­les d’une image de micro­sco­pie et ensuite géné­rer plu­sieurs sta­tis­ti­ques sur les cel­lu­les détec­tées comme l’inten­sité, la taille ou encore la posi­tion de celles-ci. La docu­men­ta­tion de l’exten­sion est plutôt claire, ce qui en faci­lite l’uti­li­sa­tion. Je vous invite à la consul­ter pour un aperçu rapide de ses fonc­tions.

Détection automatique des cellules : un avantage indéniable

Généralement, dans une popu­la­tion de cel­lu­les, toutes les cel­lu­les ne sont pas syn­chro­ni­sées au même stade de crois­sance. Pour cette raison, les dif­fé­ren­tes cel­lu­les d’une popu­la­tion peu­vent avoir des com­por­te­ments dis­tincts dans un même test in vitro. Il peut donc être avan­ta­geux de les sépa­rer ou de les ana­ly­ser de façons dif­fé­ren­tes. Par exem­ple, dans la popu­la­tion de cel­lu­les mon­trée sur l’image sui­vante, il y a au moins deux phé­no­ty­pes dif­fé­rents qui se com­por­tent dif­fé­rem­ment dans un test in vitro de cap­tage d’un com­posé fluo­res­cent. Les cel­lu­les en petits amas cap­tent le com­posé alors que les cel­lu­les iso­lées, plus lon­gues et plus volu­mi­neu­ses ne réa­gis­sent pas. Sur la figure, les cel­lu­les sont mar­quées avec un mar­queur fluo­res­cent qui s’asso­cie aux mem­bra­nes des cel­lu­les (vert) et les noyaux avec le DAPI (rouge).

Directement à partir de ces deux mar­qua­ges, il est pos­si­ble de cons­ta­ter qu’il y a au moins deux phé­no­ty­pes évidents. D’abord, les cel­lu­les plus allon­gées et volu­mi­neu­ses sont mar­quées plus for­te­ment par le mar­queur de mem­brane (vert). Aussi, les noyaux de ces mêmes cel­lu­les sont beau­coup moins inten­ses (bleu) que les noyaux des peti­tes cel­lu­les en amas. Toutes ces carac­té­ris­ti­ques pour­raient être exploi­tées avec EBImage et R pour sélec­tion­ner l’un ou l’autre de ces deux phé­no­ty­pes.

En effet, l’une des pro­prié­tés inté­res­san­tes d’EBImage est sa capa­cité à détec­ter auto­ma­ti­que des cel­lu­les d’une popu­la­tion de cel­lu­les, même si elles sont en contacts les unes avec les autres. La détec­tion se fait en uti­li­sant à la fois l’image des noyaux (qui détecte les cel­lu­les) et du mar­queur de mem­brane qui déli­mite l’espace occupé par les cel­lu­les. Plus pré­ci­sé­ment, l’algo­rithme uti­lise le prin­cipe du dia­gramme de Voronoï pour déli­mi­ter les cel­lu­les. La figure sui­vante montre un exem­ple de détec­tions des cel­lu­les.

Une fois la détec­tion effec­tuée, les options d’ana­lyse s’en trou­vent décu­plés. Bien sûr, il est pos­si­ble d’obte­nir des sta­ti­ques concer­nant cha­cune des régions (taille, aire, posi­tion, inten­sité des pixels et bien d’autres). Il est aussi pos­si­ble de trans­po­ser ces régions sur n’importe quel­les autres images et ainsi obte­nir des sta­tis­ti­ques concer­nant ces mêmes régions. Ceci rend donc pos­si­ble l’étude de plu­sieurs mar­queurs sur une même popu­la­tion de cel­lu­les ou encore l’évolution d’un mar­quage en fonc­tion du temps. Comme dis­cuté pré­cé­dem­ment, il est pos­si­ble de sélec­tion­ner des sous-popu­la­tions de cel­lu­les en fonc­tion des dif­fé­rents para­mè­tres qui ont été déter­mi­nés.

À titre d’exem­ple, la figure sui­vante (pan­neau de haut) montre la dis­tri­bu­tion d’un com­posé fluo­res­cent capté par la popu­la­tion de cel­lu­les détec­tées pré­cé­dem­ment et dans laquelle il y avait au moins deux phé­no­ty­pes. Évidemment, avec les outils de R, il est facile de tracer des gra­phi­ques de la popu­la­tion de cel­lu­les en y incluant des sta­tis­ti­ques comme la moyenne, la médiane et l’écart-type de la popu­la­tion, puis de les visua­li­ser le tout direc­te­ment sur une même image. Visuellement, il est clair qu’il y a deux popu­la­tions qui cap­tent le com­posé fluo­res­cent de façon dif­fé­rente puisqu’il y a deux pics sur le gra­phi­que. En regar­dant la fluo­res­cence des noyaux (pan­neau du centre), l’on trouve également deux pics sug­gé­rant encore une fois deux popu­la­tions de cel­lu­les dif­fé­ren­tes. Avec R, il est facile d’exclure l’une ou l’autre des deux popu­la­tions en se basant sur l’inten­sité des noyaux. Le pan­neau du bas de l’image sui­vante montre le résul­tat en excluant les cel­lu­les avec des noyaux peu fluo­res­cents. Puisqu’on n’y retrouve qu’un seul pic, ceci sug­gère que la cap­ta­tion du com­posé fluo­res­cent dépend for­te­ment du phé­no­type de ces cel­lu­les en culture.

L’ana­lyse par popu­la­tion de cel­lu­les indi­vi­duel­les n’est pas utile que dans les cas les plus com­plexes, elle permet également d’être plus sen­si­ble à détec­ter un phé­no­mène que dans la plu­part des appro­ches sim­ples qui sont aussi les plus uti­li­sées.

Plus sensible que les méthodes les plus utilisées

Bien sou­vent, les étudiants et cher­cheurs se conten­tent d’uti­li­ser la méthode qu’ils jugent la plus simple et sur­tout la plus rapide pour quan­ti­fier la fluo­res­cence. Sans contre­dits, l’appro­che pri­vi­lé­giée par la plu­part des labo­ra­toi­res est de sim­ple­ment effec­tuer la moyenne des pixels de l’image. Toutefois, l’appro­che est très sen­si­ble à la den­sité des cel­lu­les dans les puits, un para­mè­tre qui est rare­ment uni­forme. De plus, dans les expé­rien­ces avec des cel­lu­les en culture, c’est sou­vent qu’une petite pro­por­tion de l’image qui pos­sède une fluo­res­cence élevée puis­que le signal est asso­cié à des struc­tu­res cel­lu­lai­res comme des vési­cu­les, des orga­nel­les ou des mem­bra­nes. Ainsi, l’aug­men­ta­tion forte du signal dans de peti­tes régions de l’image a peu d’influence sur la dis­tri­bu­tion de l’ensem­ble des pixels de l’image (voir le pan­neau du haut de la figure sui­vante). Il est donc dif­fi­cile de détec­ter tout phé­no­mène sur des cel­lu­les en culture avec cette appro­che, sur­tout que la varia­bi­lité est sou­vent grande puisqu’elle dépend de la den­sité des cel­lu­les sur l’image.

Pour cor­ri­ger le pro­blème de den­sité (ou confluence), une appro­che régu­liè­re­ment uti­li­sée est de faire la moyenne des pixels seu­le­ment où il y a de la fluo­res­cence au dessus d’un cer­tain seuil. Par contre, avec cette appro­che, la détec­tion des régions d’inté­rêts dépend gran­de­ment de l’inten­sité du signal à quan­ti­fier, ce qui est pro­blé­ma­ti­que dans les condi­tions où le signal est faible (voir le deuxième pan­neau de la figure sui­vante).

La meilleure appro­che pour quan­ti­fier le signal, mais peu uti­li­sée en géné­ral, est de détec­ter les cel­lu­les avec un autre mar­queur que la fluo­res­cence à quan­ti­fier, ce qui permet de réa­li­ser des contrô­les néga­tifs qui ne contien­nent pas le fluo­ro­phore à quan­ti­fier. Par contre, cette appro­che a le même pro­blème que l’appro­che de la moyenne des pixels de l’image com­plète, c’est-à-dire qu’elle est peu sen­si­ble pour détec­ter des chan­ge­ments asso­ciés à des cel­lu­les en culture.

Le pan­neau du bas de l’image sui­vante montre que la méthode des cel­lu­les indi­vi­duel­les est plus sen­si­ble. Elle permet notam­ment de foca­li­ser sur le signal réel à quan­ti­fier, c’est-à-dire les cel­lu­les ou une sous-région à l’inté­rieur de celles-ci, en mini­mi­sant l’impact du bruit de fond.

Conclusion

Bien que la détec­tion auto­ma­ti­que des cel­lu­les soit rela­ti­ve­ment com­plexe, l’exten­sion EBImage rend cette appro­che extrê­me­ment simple d’uti­li­sa­tion. Le fait qu’EBImage soit uti­li­sa­ble dans R permet de béné­fi­cier de toute la puis­sance sta­tis­ti­que et gra­phi­que du logi­ciel et de faire des études à grande échelle avec un mini­mum d’étapes. Même dans une étude explo­ra­toire, il est avan­ta­geux d’uti­li­ser cette appro­che puisqu’elle permet de détec­ter des phé­no­mè­nes plus sub­tils qu’avec la plu­part des autres appro­ches sim­ples.

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